Anónimo
Anónimo preguntado en Sociedad y culturaOtros - Sociedad y Cultura · hace 1 década

¿que es el suero de una persona 10 PuNtOS Y 5 EsTrELlaS?

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  • hace 1 década
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    Sueros humanos

    Las muestras de sangre fueron obtenidas bajo completo consentimiento informado de los participantes. Se utilizaron 10 sueros de personas con fasciolosis demostrada por serología y coprología, 14 sueros de personas sanas negativas por todas las pruebas a la infección y 29 sueros de personas con otras parasitosis distribuidas de la siguiente manera: con Paragonimus sp. 2, Schistosoma mansoni 3, Taenia sp. 3, cisticercosis 3, hidatidosis 3, Hymenolepis nana 2, Anquilostomideos 3, Strongyloides stercolaris 3, Ascaris lumbricoides 3, Toxocara sp. 2, Trichuris trichiura 2.

    Obtención de antígenos de excreción-secreción de F. hepatica (AFhES)

    Los ejemplares adultos de Fasciola hepatica se extrajeron de los conductos biliares de bovinos infectados y fueron lavados con solución salina estéril. De 10 a 15 vermes se colocaron en 20 mL de medio RPMI + penicilina-estreptomicina, en viales de cultivo Falcon®. Se incubaron en cámara de CO2 a temperatura ambiente por 6 horas, luego de lo cual se descartó el medio sustituyéndolo por medio nuevo y se dejó por 12 horas más. Una vez retirados los vermes, se añadió al medio una mezcla de inhibidores de proteasas fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF) y EDTA, 2mM y 1mM respectivamente, se centrifugó a 3.376 g, a - 4 ºC por 30 min, el sobrenadante se congeló a -70 ºC y luego se liofilizó por 10 horas continuas (12) (21). Posteriormente, se resuspendió con PBS 0,15 M y se determinaron proteínas por el método de Bradford (22). A esta preparación se la denominó AFhES.

    Ultrafiltración molecular del AFhES

    Se ultrafiltraron porciones de aproximadamente 2 mL del AFhES, en distintos dispositivos de filtración por centrifugación con membranas YM de celulosa regenerada (CENTRICON®), cada una con poros de tamaño diferente, con límites de 3, 10, 30 y 50 kDa. El dispositivo con membrana YM de 3 kDa se centrifugó a 5.000 g por 45 min; los demás con membranas YM 10, 30 y 50 se centrifugaron a la misma velocidad por 30 min. Luego de la centrifugación, el preparado resultante se distribuyó en dos fracciones, una que contenía un concentrado con moléculas mayores que el poro de la membrana, denominada retenidos (R), y otra que contenía los filtrados (F), con moléculas de menor tamaño que el poro utilizado. Los retenidos se indican como R3, R10, R30 y R50 (según membrana utilizada) y los filtrados como F3, F10, F30 y F50, según el caso (Fig. 1). Se determinó la concentración proteica en cada fracción obtenida y seguidamente se almacenaron a -70 ºC.

    Figura 1. Esquema de ultrafiltración molecular del antígeno de excreción-secreción de adultos de Fasciola hepatica (AFhES) con dispositivos micro-concentradores (CENTRICON®).

    Inmunoensayo enzimático con las fracciones obtenidas del AFhES

    Se siguió la técnica descrita por Voller et al. (23) con algunas modificaciones. Con los retenidos (R3-R50) del AFhES se sensibilizaron micro-placas de ELISA (Maxi Sorp, NUNC®), con 50 µL/pozo de cada fracción a una concentración de 10 µg/mL. Luego de 18 h a 4 ºC, las placas se lavaron dos veces con buffer salino fosfato (PBS) con 0,05% de Tween 20. Para el bloqueo se colocaron 150 µL/pozo de solución de leche descremada al 5% en PBS-Tween 20 al 0,05% por 1 h.

    Los sueros se diluyeron 1/200 en la misma solución de bloqueo, colocando 50 µL/pozo por 1 h a 37 ºC. Las placas se lavaron 3 veces con PBS-Tween 20 al 0,05% y se expusieron a 50 µL/pozo de solución de anti IgG-humana conjugada a fosfatasa alcalina (1/2000) en la misma solución de bloqueo. Se revelaron las placas usando 50 µL/pozo de p-nitrofenilfosfato (PNPP) a una concentración de 1 mg/mL como sustrato de la enzima. Luego se detuvo la reacción con 50 µL/pozo de una solución de NaOH 3M. El punto de corte se estableció en base al promedio más tres desviaciones estándar de la densidad óptica de 40 sueros negativos.

    Electroforesis y Western blot con las fracciones del AFhES (>3 a >50 kDa)

    Se realizó electroforesis con aproximadamente 72 µg de cada fracción de AFhES, diluidos en 300 µL de buffer de muestra, en gel de poliacrilamida al 12,5%, bajo condiciones disociantes y no reductoras, luego se transfirió a papel de nitrocelulosa (NC) (24)(25). A continuación, las membranas de NC se bloquearon con leche descremada al 5% en PBS-Tween 20 al 0,05%, al término de lo cual se secaron y guardaron a -20 ºC hasta su uso.

    El papel de NC se cortó en tiras de 2 mm, las cuales se expusieron a 800 µL de suero humano diluido 1/200 en solución de bloqueo, por 90 min, en constante agitación a temperatura ambiente. Luego se realizaron 4 lavados de 15 min cada uno con PBS-Tween 20 al 0,05%. Seguidamente las tiras se colocaron en una solución de anti-IgG humana conjugada a peroxidasa (1/15.000) en solución de bloqueo por 90 min, en agitación constante. Se repitieron los lavados y se procedió a exponer las tiras al sustrato quimio-luminiscente (SuperSignal®) por 1 min. La reacción se evidenció por revelado usando placas fotográficas (HiperfilmTM, Amer

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