Dave preguntado en Ciencias y matemáticasBiología · hace 1 década

Orcinol.....?

Saben el uso de orcinol qué reacción produce en sustancias con ácidos nucleicos???

Reacción de orcinol con precipitado de ácidos nucleicos y con soluciones patrón de ADN y ARN.

Y la parte mas importante de la pregunta, en la reaccion la cantidad de orcinol es un factor de cambio

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  • hace 1 década
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    HOLA!!

    www.pucmmsti.edu.do/cienciasfisiologicas/BQMA-RB1.PDF

    AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS A PARTIR DE CÉLULAS EUCARIOTAS

    Introducción

    Los ácidos nucleicos (DNA y RNA) de un tejido animal se extraen a partir de un homogeneizado de células. Este se obtiene por ruptura de las células en un tampón utilizando un homogeneizador. Las membranas lipídicas se convierten en solubles en presencia del detergente dodecil sulfato sódico (SDS), que también desnaturaliza las proteínas. Todas estas impurezas se eliminan extrayendo la mezcla acuosa resultante con varios compuestos orgánicos inmiscibles con agua como son el fenol y el cloroformo. La emulsión turbia se centrifuga y aparecen dos fases: la inferior es de naturaleza orgánica y, junto con la interfase, contiene los contaminantes proteicos y lipídicos. La fase superior, acuosa, contiene los ácidos nucleicos, DNA y RNA, en disolución. Los ácidos nucleicos se recuperan por precipitación con etanol. Una vez precipitados, en razón de sus distintas propiedades físicas y químicas, el DNA se separa por enrollamiento sobre un capilar de vidrio y el RNA por centrifugación a baja temperatura.

    Material y reactivos

    Baño con termostato. Bomba de succión manual. Capilar de vidrio. Centrífuga de mesa. Congelador a -20ºC. Gradilla. Homogeneizador. Pipetas. Tubos de polipropileno de 10 mL.

    Cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Dodecil sulfato sódico (SDS) al 10% (p/v). Etanol al 100%. Etanol al 70%. Fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1). Solución tamponada de fenol. Tampón citrato sódico salino (SSC) 1x: NaCl 0,15 M; citrato sódico 0,015 M. Tampón de homogeneización: NaCl 0,2 M; Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0; EDTA 0,02 M. Tejido animal.

    Procedimiento

    1. Pesar el tejido y homogeneizarlo en una proporción 10 mL/g en tampón de homogeneización (este paso no lo realiza el alumno). Cada pareja parte de 3 mL de muestra.

    2. Añadir 0,15 mL de solución de SDS al 10%. Mezclar el contenido invirtiendo el tubo y evitando la formación de espuma.

    3. Extraer la fase acuosa con 1 volumen de disolución equilibrada de fenol. Mezclar por inversión ambas fases durante 10 minutos para que se forme una emulsión fina.

    4. Separar la fase acuosa (superior) de la orgánica (inferior) centrifugando a 3.000 rpm durante 10 minutos. Trasladar la fase acuosa a un tubo limpio. Evitar en todo momento perturbaciones de la interfase que contaminen la fase acuosa.

    5. Extraer la fase acuosa con 1 volumen de disolución de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1). Mezclar por inversión para emulsionar, durante 10 minutos, y repetir el paso 4.

    6. Extraer la fase acuosa con 1 volumen de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Mezclar por inversión durante 10 minutos. Separar ambas fases en las mismas condiciones que en el apartado 4. Transferir la fase acuosa (superior) a un tubo limpio.

    7. Añadir a la fase acuosa 2 volúmenes de etanol al 100%. Mezclar por inversión y observar el precipitado de DNA genómico.

    8. Obtener el precipitado enrollándolo a un capilar de vidrio y transferir el DNA a un tubo limpio y seco. Dejar secar el DNA al aire.

    9. Poner el tubo en el que se obtuvo el precipitado de DNA a -20ºC durante toda la noche, para provocar la precipitación del RNA.

    10. Centrifugar a 10.000 rpm durante 15 minutos. Eliminar el sobrenadante y secar al aire el sedimento de RNA.

    11. Resuspender, por separado, los precipitados de DNA y RNA en 2 mL de SSC 1x.

    SALU2!!!

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